浙大冯建东团队今日Nature电化学反应成像技术

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　　第一作者：董金润、卢禹先
　　通讯作者：冯建东研究员
　　通讯单位：浙江大学化学学院
　　论文DOI：10。1038s41586021037159
　　全文速览
　　化学反应在概念上可以解释为单个分子转化为产物的过程，但实验中观察到的现象通常为整体的平均行为。作为超越整体平均学的方法，单分子技术可以清晰地揭示出反应位置、路径和动力学的统计分布。然而，单分子溶液化学的探测仍然具有挑战性。在本文中，浙江大学冯建东研究员等课题组报导了一种在水溶液中的单分子电化学反应光学成像技术，并探究了其在超分辨率显微镜中的应用。该方法利用在电极上电化学生成的钌络合物的化学发光反应，确保最小的背景信号。因此，该体系能够直接捕获单个反应中电化学发光的单光子，并开发出超分辨电化学发光显微镜，用以在高时空分辨率下对活体细胞的粘附动力学进行揭示。该方法不仅可以促进对电化学反应的基本理解，而且在生物测定和细胞成像领域有很重要的应用。
　　背景介绍
　　简单来说，作者的实验来自于观察通道内的孤立电化学发光（ECL）反应，该通道中的单分子ECL反应只能发射一个光子。所采用的ECL模型系统为钌络合物tris（2，2联吡啶）钌（II），Ru（bpy）32。该络合物可与tri正丙胺（TPrA）反应再生，其氧化还原反应过程如下所示。
　　如上式所示，单个Ru（bpy）32分子首先在氧化铟锡（ITO）电极表面的非均相电化学反应中被氧化。随后，在溶液中被TPrA的自由基通过均相反应中进行还原生成钌络合物，并放出一个携带hv2eV的单光子。
　　基于上述机制，作者开发出一种用于监测水溶液中单分子钌基ECL反应的组合式光学成像和电化学记录系统。该ECL反应由一个典型的三电极电化学体系进行触发和控制，该体系产生工作电压，并使用低噪声电流放大器记录电化学电流。此外，使用ITO薄电极和倒置显微镜进行同步电化学测试和光学成像。在施加电压时，在透明ITO电极的表面发生反应，所发射出的光子被底部的高数值孔径物镜收集，然后由高效率、低读出噪声的电子倍增电荷耦合器件相机探测。这种单分子ECL成像技术不仅可以替代和补充基于荧光的单分子成像方法，也可以应用于生物测定和细胞成像等领域。
　　图文解析
　　图1。单分子ECL成像装置及对随机反应的观测：（a）组合式光学成像和电化学记录装置示意图，其中工作电极（WE）为ITO，参比电极（RE）为AgAgCl，对电极（CE）为Pt片，DAQ代表数据采集，LCA为低噪声电流放大器；（b）循环伏安曲线与ECL电压曲线；（c）Ru（bpy）32的ECL发射光谱；（d）电流密度，（e）施加电压、（f）光子数量，（g）模拟数字（AD）计数的同步信号，其中红色虚线表示相应的单光子强度，所观测的同步信号来自于50MRu（bpy）32和50mMTPrA，曝光时间为0。507ms，电子增益为500。
　　图2。不同暴露时间下单分子反应的观测结果：（ad）成像模式（左）和光子计数（右）图像；（a）曝光时间为0。507ms时的ECL背景；（bd）曝光时间为0。507ms（b）、4ms（c）和15ms（d）时的ECL信号；（eh）图ad中选定区域的光子计数；（i）在不同的曝光时间时，图像模式下整个视野的平均AD计数；（j）不同曝光时间时的信号饱和度，该处的饱和度定义为一帧中检测到信号的像素百分比；（k）不同曝光时间下采集信号的光子计数分布。
　　图3。单分子ECL反应的动力学分析：（a）摄像机AD计数与光子计数时间追踪，间隔时间为两个相邻事件的时间差，信号采集于1。4V固定电压下的含有50mMTPrA的50MRu（bpy）32溶液中；（b）三次扫描测试中间隔时间与Ru（bpy）32浓度的关系，误差棒来自于单指数拟合；（c）图b对应的不同扫描测试下的每帧事件数，曝光时间和电子增益分别为0。507ms和500。
　　图4。ITO结构上的单分子ECL成像：（a）图案化ITO成像模板和单分子ECL事件，钌络合物探针在溶液中处于自由状态，其在ITO表面碰撞和ECL反应后的电极表面受限区域发光。；（b）聚焦离子束（FIB）图案化ITO的扫描电子显微镜图，比例尺为3m；（c）图b中的强度剖面图；（d）图b中所示相同FIB图案化ITO的超分辨单分子ECL图；（e）图d中的强度剖面图；（f）三组反应位点的代表性团簇；（g）三组随机选择区域（ROIs）的图像分辨率FRC量化结果；（h）在FIB图案化的ITO（背景计数校正）上对所选ROIs（300nm300nm，由d中的白色箭头所示）进行的定量定位分析。
　　图5。活体细胞的单分子ECL成像：（a）ITO表面上单个活体HEK293细胞的明场图像，比例尺为5m；（b）图a中同一细胞的超分辨ECL图像，比例尺为5m；（c）基底上局部粘附区域的ECL图像，比例尺为2m；（d）图c中同一区域的超分辨ECL图像，比例尺为2m；（e，f）在不同时间下（36秒、48秒、60秒和72秒）对图b中所选区域的细胞粘附进行动态可视化观察，其中，顶部矩形选择对应于图e，底部矩形选择对应于图f，比例尺为1m；（g）图e（蓝点）和图f（黑点）中粘附区域的时间演化分析。
　　总结与展望
　　在本文中，作者成功设计出一种在水溶液中的单分子电化学反应光学成像技术，并探究了其在超分辨率显微镜中的应用。该方法利用在电极上电化学生成的钌络合物的化学发光反应，确保最小的背景信号。因此，该体系能够直接捕获单个反应中电化学发光的单光子，并开发出超分辨电化学发光显微镜，用以在高时空分辨率下对活体细胞的粘附动力学进行揭示。这种单分子ECL成像技术不仅可以替代和补充基于荧光的单分子成像方法，也可以应用于生物测定和细胞成像等领域。
　　通讯作者介绍
　　JiandongFeng（冯建东），JiandongFengstudiedengineeringandreceivedhisBachelor’sdegreeinchemistryfromZhejiangUniversity。HeobtainedhisPh。D。inphysicsfromSwissFederalInstituteofTechnologyinLausanne（EPFL）in2016underthesupervisionofProf。AleksandraRadenovic。JiandongFengcontinuedasapostdocintheBioengineeringInstituteofEPFL。InMarch2018，heestablishedtheLaboratoryofExperimentalPhysicalBiologyatZhejiangUniversity。Dr。Fengisinterestedindevelopingandapplyinghighprecisionsinglemoleculetoolsforprobingnanofluidics，biophysicsandchemistryatunexploredscales。HeisarecipientoftheEPFLDoctorateAward，EPFLFutureLeadersinBioengineeringAwardandtheChineseGovernmentAwardforOutstandingStudentsAbroad。
　　文献来源
　　JinrunDong，YuxianLu，YangXu，FanfanChen，JinmeiYang，YuangChen，JiandongFeng，Directimagingofsinglemoleculeelectrochemicalreactionsinsolution。Nature。2021，DOI：10。1038s41586021037159。
　　文献链接：https：doi。org10。1038s41586021037159