Primereditor基因编辑服务介绍

　　Primereditor（PE）被称为先导编辑，是一种不需要DNA双链断裂，不需要HDR情况下，通过融和逆转录酶，实现在基因组定点区域引入碱基替换、基因敲入，基因敲除的精确基因编辑方法，被称为CRISPRCas9系统真正的竞争者。Primereditor（PE）主要原理是CRISPRCas9系统的引导切割功能和逆转录酶对模板反转录后对基因组的替换功能相结合，达到基因精确编辑目的。Primereditor与CRISPRCas9系统不同的是其基于改造的向导RNA（primeengineeredguideRNApegRNA），pegRNA包含我们所熟知的singleguideRNAs（sgRNAs），不同的是，在其3’端还有一段引物结合序列（primerbindingsite，PBS）和逆转录模板序列（RTtemplate）。Primeeditor蛋白Cas9切口酶（Cas9nickaseH840A）和逆转录酶（MMLVRT）融合而成。
　　在primeeditor系统中，Cas9切口酶在pegRNA上的sgRNA的引导下，切割与PAM（NGG）同链的DNA单链，pegRNA3’端的PBS（引物结合序列）会与切割断点前的碱基识别配对。逆转录酶，如MMLVRT，它以PBS序列后面的设计的反转录模板进行逆转录，将目的序列直接聚合到切口的DNA链上。PAM链上被切割后，该单链DNA会进入3’侧翼（3’flaps）和5’侧翼（5’flaps）同时存在的动态平衡状态，但5’侧翼（5’flaps）会被具有5’核酸内切酶和5’核酸外切酶活性的FEN1和具有5’核酸外切酶活性的EXO1蛋白切割。因此3’侧翼（3’flaps）通过反转录酶合成的编辑序列就可以以更大的概率保留在后面修复的序列中。通过这套系统，可以在无需引入双键断裂和外源DNA模板的情况下，有效地生产精确的碱基转换和颠换、插入和缺失等变异。
　　鼠白血病病毒（MMLV）的MMLVRT外，Primereditor的逆转录病毒还可以替换成禽成髓细胞瘤病毒（AMV）的AMVRT，花椰菜花叶病毒（CaMV）的CaMVRT，甚至艾滋病（HIV1）的HIV1RT等。这些RT在逆转录错误频率上存在一些差异，例如，HIV的逆转录酶错误率是逆转录病毒的平均水平的10倍，MMLV逆转录酶错误率是逆转录病毒的平均水平的110。
　　为了实现更高的编辑效率且引入更低的得失位，PE系统进一步升级为PE3和PE3b系统。上图为PE和PEb作用机制图，当初始DNA单链上的序列X被人工设计的反转录序列替换为Y时，存在切口的DNA单链就会进入3’侧翼（3’flaps）和5’侧翼（5’flaps）存在的动态平衡状态，如果3’侧翼被切除掉，那么反转录的Y序列也随之被切除，基因组修复连接后恢复为最初状态，未发生变化，因而继续进入下一个编辑循环；如果5’侧翼被切除，PE3和PE3b系统（Cas9D10A和一条gRNA）会在PAM链互补链下游打开一个切口，此时，带有切口的非编辑链会被优先修复，因此会使得编辑效率比没有在非编辑创建切口的PE2和PE1的编辑效率更加高效。
　　当然，只有在编辑链5’侧翼被切除后再对非编辑链进行切口能够最大限度的减少
　　双链断裂和引入得失位。为了解决编辑与切口的先后顺序，PE3b被开发出来，Cas9D10A的gRNA被设为编辑后的前间区序列。当PAM发生编辑后，gRNA才能够与目标链发生配对，在互补链打开一个缺口，从而更小的引入得失位。
　　在293T细胞的体内编辑结果显示，PE3和PE3b显示出更高的编辑效果。而PE3b有更低的得失位的引入。通过在哺乳动物细胞基因组中实现精确的定向转移、倒置、插入和删除，而不需要DNA双链断裂DSB、供体DNA模板或HDR，PE3提供了一种新的编辑和替换能力，大大扩展了基因组编辑的范围和精确度。
　　基恩科生物提供基于Primereditor的细胞基因编辑和载体构建服务。