生产过程清洁验证残留物阿哌沙班的HPLC法测定

　　摘要目的：建立清洁验证中残留物阿哌沙班含量测定的高效液相色谱法。方法：色谱柱为WatersNovaPakC18（3。9mm150mm，5m），流动相为乙腈水（3070），检测波长280nm，流速1。0mlmin，柱温30，进样量10l。结果：阿哌沙班在0。0120gml范围内线性关系良好，r20。9992；回收率为75。90，RSD2。33（n18）。结论：该方法操作简便、结果准确，可以用于清洁验证残留物阿哌沙班的定量分析。
　　关键词高效液相色谱法清洁验证残留物阿哌沙班
　　中图分类号：R973。2；O657。72文献标识码：A文章编号：10061533（2016）09007603
　　DeterminationofapixabanresiduesincleaningvalidationbyHPLC
　　ZHANGXuan，YUQinghua，WANGZiyuan，JINLei
　　（ShanghaiShyndecPharmaceuticalCo。Ltd。，Shanghai200137，China）
　　ABSTRACTObjective：ToestablishamethodforthedeterminationofapixabanresiduesinthecleaningvalidationbyHPLC。Methods：HPLCwascarriedoutonaWatersNovaPakC18column（3。9mm150mm，5m）withacetonitrilewater（3070）asthemobilephaseatthedetectionwavelengthof280nmandtheflowvelocityof1。0mlminandthecolumntemperatureof30withsamplesizeof10l。Results：Thestandardcurveofapixabanshowedagoodlinearrelationshipintherangeof0。01to20gmlwiththecorrelationcoefficient（r2）of0。9992。Theaveragerecoveryofsampleswas75。90withRSDof2。33（n18）。Conclusion：Thismethodisconvenientandaccurateandsuitableforthequantitativedeterminationofapixabanresiduesinthecleaningvalidation。
　　KEYWORDSHPLC；apixaban
　　作为Xa因子抑制剂的阿哌沙班是一种用于预防和治疗血栓的新型口服抗凝药物〔1〕，其制剂阿哌沙班片是我们公司研发中心研制的新药，在上海浦东基地与其他产品共线生产。为确保该产品与其他产品在生产中不造成交叉污染、降低阿哌沙班片的生产对其他产品造成的质量风险，本研究参考GMP验证要求确定了阿哌沙班片清洁验证设备残留限度（86g25cm2）后〔23〕，参考药典要求〔4〕、根据活性物阿哌沙班的结构特征和HPLC测定特点建立了阿哌沙班的残留物HPLC分析方法，通过对阿哌沙班片生产用设备清洁验证的检验，确定该方法可以用于阿哌沙班片在生产过程清洁验证中的残留物检测，保证清洁验证的准确性，并对每个验证参数设立可接受标准，结果表明高效液相色谱法（HPLC）简便，准确，可在清洁验证中用于阿哌沙班残留物的定量分析。
　　1试验仪器与试验样品
　　高效液相色谱仪LC20AD（日本岛津公司），电子天平（瑞士MettlerXS205），阿哌沙班对照品（批号：1403008，含量：99。47，上海现代制药股份有限公司），乙醇（AR，国药集团化学试剂有限公司），乙腈（HPLC纯，默克公司）。
　　2方法与结果
　　2。1色谱条件
　　色谱柱为WatersNovaPakC18（3。9mm150mm，5m），流动相为乙腈水（3070），检测波长280nm，流速1。0mlmin，柱温30，进样量10l。
　　2。2专属性试验
　　精密称取阿哌沙班对照品约50mg，置于50ml量瓶中用乙醇溶解并稀释至刻度，精密量取1。0ml置于100ml量瓶中，用乙醇稀释至刻度作为对照品溶液（10gml）。用镊子夹取医用脱脂棉两小团，用乙醇润湿后放入10ml具塞试管中，加入10ml乙醇，超声15min，放置20min，期间不时振摇，取上清液作为空白医用脱脂棉浸出液。按色谱条件分别对阿哌沙班对照品溶液、空白乙醇和空白医用脱脂棉浸出液进样测定，结果表明乙醇空白和空白医用脱脂棉浸出液的各杂质出峰时间对检验标的物阿哌沙班的出峰不造成干扰（图1）。
　　2。3线性关系试验
　　取阿哌沙班对照品和乙醇分别制备成对照品溶液线性关系试验溶液（0。01、0。1、0。5、1、10和20gml），各浓度溶液分别进样2次，每次10l，得各色谱图。统计出阿哌沙班峰面积线性关系，建立校正曲线。以阿哌沙班测得的平均峰面积X为横坐标，以线性溶液溶度Y为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y5。0106X，相关系数R20。9992；结果表明该方法在0。0120gml浓度范围内，线性关系良好。
　　2。4检测限和定量限
　　采用信噪比法，取线性研究中合适浓度的溶液逐步稀释得已知低浓度溶液，以信噪比101时的相应浓度为进样量10l时的定量限；以信噪比31时的相应浓度为进样量10l时的检出限。结果确定该法的检出限为0。0037gml，定量限为0。0112gml。
　　2。5重复性试验
　　根据擦拭取样限度86g25cm2计算可知供试品溶液的检出限度应为8。6gml，选择与供试品溶液限度接近的专属性试验中配制的对照品溶液（10gml）进行重复性试验。重复进样5次测定，计算5次所得阿哌沙班峰面积的RSD值为0。16（表1），表明该方法重复性良好。
　　2。6回收率试验
　　在一块面积为25cm25cm的平整光洁的不锈钢板上用钢锥每隔5cm划线，形成25块5cm5cm的正方块。精密量取专属性试验中配制的对照品浓溶液（1mgml）0。1ml均匀地滴加在不锈钢板中间的1个5cm5cm的正方块上，让稀释液自然挥发。用镊子夹取一小团脱脂棉花，先用乙醇润湿，并将其靠在溶剂瓶上以除去多余的水。将棉团平稳而缓慢地从水平方向擦拭整个取样表面（面积为5cm5cm）。然后，翻转棉团，让其从垂直方向也进行擦拭取样（图2）。擦拭好的棉团立即放入10ml的具塞试管中，另取一新的用乙醇润湿的棉团，将方块中残留的溶液擦拭干净，放入同一支10ml具塞试管中，加入10ml乙醇，超声15min，放置20min，期间不时振摇。
　　一个取样人员平行擦拭三组，每组擦拭六次。擦拭结果如表2。计算三组平均回收率为75。90，RSD为1。04。
　　3讨论
　　设备清洁验证是制药企业生产产品过程中避免共线产品交叉污染、保证产品质量、确保患者用药安全的重要手段之一。清洁验证中，确保清洁效果、影响验证结果的因素众多，如清洁验证范围、产品评估、设备评估、标记物的选择和评估、清洗程序的选择和评估、检验方法的选择和评估等等〔56〕，而其中，检验方法是通过分析方法的验证来保证分析结果的真实可靠的〔7〕，进而确保整个清洁验证结果准确可靠的。
　　文中试验的验证结果表明，HPLC法测定清洁验证中的残留物阿哌沙班的含量方法专属性试验、线性关系、重复性、回收率均符合相应要求，定量限、检出限足以满足残留限度检验要求，该方法可用于阿哌沙班片相关设备清洁验证中活性成分阿哌沙班的定量分析。在清洁验证时，应采用乙醇作为溶剂、医用脱脂棉蘸取乙醇后擦拭取样；测定限值为阿哌沙班残留量限值回收率，按最严格要求取回收率为各组平均回收率的最小值，故测定限值为65g25cm2。
　　在清洁验证中，设备取样回收率实验容易被忽略，使用擦拭法取样时，由于设备材质不同，设备表面的平滑程度不同以及擦拭力度的差异，对采用结果会有不同程度的影响〔8〕，故在设备材质确定的情况下，应由方法验证进行回收率试验时的取样人员、采用同等力度进行擦拭取样，如需更换取样人员应重新进行相应方法擦拭回收率试验。同时，在日常清洁中，对员工的培训与管理、确保清洁过程按照验证程序进行，也是保证设备清洁维持在验证状态、清洁验证结果对生产清洁过程有指导性意义的前提〔910〕。
　　参考文献
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